Palestrinas karriere begyndte som kordreng i byen Palestrina og i Rom.
1 1544 blev han ansat som organist i domkirken i Palestrina. I 1551 blev han ansat ved det pavelige kapel i Peterskirken i Rom.
I 1560'erne og 1570s'erne vandt Palestrina mere og mere indflydelse og berømmelse, og han fik til opgave at revidere den musik, der anvendtes i de katolske kirker.
Palestrina skrev 105 messer, mere end 250 motetter, så vel som anden kirkelig og verdslig musik.

Palestrinas indflydelse på den flerstemmige kormusik er betydelig. Der undervises den dag i dag i "Palestrinakontrapunkt" som en del af den teoretiske musikundervisning.